Отзывы к статье
Туберкулез, БЦЖ и проба Манту. Ответы на частые вопросы.
Cтраница 85

Скрыть

Опыт применения тест-системы “АТ-Туб-Бест” для диагностики туберкулёза
С.Е. Гладкова, С.С. Решетников, В.Н. Пряхина*
ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск
*Кафедра фтизиопульмонологии Новосибирского государственного медицинского университета
Ведущую роль в диагностике туберкулёза в настоящее время продолжают играть классические методы: идентификация культуры возбудителя в посеве мокроты пациента и иных биологических жидкостях, гистологическое определение микобактерий в мазках после окраски прочным синим (AFB-метод), рентгеноскопия грудной клетки и очагов поражения в других органах [1–3]. Ограничения этих методов диагностики хорошо известны: невозможность выявить возбудителя при абациллярной форме туберкулёза, длительность процедуры культивирования возбудителя, неоднозначность картины рентгеноскопии при ряде сопутствующих заболеваний (СПИД, онкологические заболевания и др.) [3–5]. Из серологических методов, применяемых для лабораторной диагностики туберкулёза, чаще используется комбинация классических тестов, основанных на реакциях непрямой гемагглютинации (РНГА), поглощения комплемента (РПК) и пассивного гемолиза (РПГ). Несколько реже используются различные варианты определения циркулирующих антител (АТ) к антигенам микобактерий, основанные на методе иммуноферментного анализа (ИФА) [1, 3, 6–8].

Справедливости ради следует отметить, что в среде практикующих фтизиатров все еще продолжается дискуссия об обоснованности диагностики туберкулёза, опирающейся на определение специфических антител в периферической крови. Дискуссия базируется в основном на том постулате, что при туберкулёзе главное (протективное) значение имеет клеточный иммунитет и при заболевании именно он должен претерпевать наиболее значимые изменения. Вместе с тем невозможно отрицать то, что все реакции иммунной системы взаимосвязаны и, следовательно, изменение клеточного звена иммунитета неизбежно должно сопровождаться изменением ее гуморального звена.

Известно, что туберкулёзная инфекция (не заболевание, а именно инфекция без клинических признаков заболевания) широко распространена в популяции и охватывает до 90% населения старше 35–40 лет [1, 9, 10]. Достаточно часто (но не всегда!) объективным подтверждением наличия инфекции является проба Манту, свидетельствующая об определенной напряженности клеточного иммунитета. Практически у всех таких людей в крови можно обнаружить и антитела к возбудителю туберкулёза. Однако уровни специфических антител при этом, как правило, остаются достаточно низкими. При снижении иммунитета и индукции заболевания уровни соответствующих антител в крови и/или других биологических жидкостях существенно возрастают, причем часто это происходит раньше появления первых клинических признаков. Однако досадное своеобразие туберкулёза заключается в том, что в процессе развития заболевания могут формироваться различного типа преходящие (лабильные) иммунодефициты, осложняющие иммунодиагностику [1, 11, 12].

Конечно, диагностика туберкулёза, основанная на определении специфических АТ, имеет некоторые ограничения. Однако если ясно представлять иммунологический феномен активного туберкулёза и интерпретировать результаты анализа АТ с учетом всей совокупности клинических признаков и результатов объективной диагностики, то появляется возможность дифференцировать заболевание, определить его фазу или составить обоснованный прогноз его дальнейшего развития. Диагностическая ценность соответствующих иммуноферментных тест-систем подтверждена их широким применением в лабораторной диагностике туберкулёза за рубежом [1, 6–8].

В настоящем сообщении представлены результаты изучения чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы “АТ-Туб-Бест”, которая разработана и уже несколько лет серийно выпускается ЗАО “Вектор-Бест” [13]. Тест-система позволяет регистрировать у обследуемых лиц уровни антител к M. tuberculosis, характерные для активного туберкулёза. С учетом возможного наличия у пациентов селективных иммунодефицитов данная тест-система сконструирована так, чтобы выявлять в сыворотке или плазме крови человека специфические АТ всех трех основных классов иммуноглобулинов: G, M и A. При необходимости процедура анализа может быть адаптирована и для работы с другими биологическими жидкостями: мочой, мокротой, бронхо-альвеолярным лаважем, слюной и т.д.

Для исследования использовали образцы сыворотки крови больных с различными клиническими формами туберкулёза из городского туберкулёзного диспансера (Новосибирск), а также пробы контрольной группы, состоящей из условно здоровых доноров и пациентов с некоторыми заболеваниями нетуберкулёзной этиологии (табл. 1). Результаты тестирования сывороток с использованием тест-системы “АТ-Туб-Бест” показали, что у большинства больных независимо от формы туберкулёза выявляются повышенные уровни суммарных АТ к M. tuberculosis. Минимальную чувствительность (61%) тест-система продемонстрировала при туберкулёзе лимфатических узлов, максимальную – при казеозной пневмонии, фиброзно-кавернозном туберкулёзе легких (86–87%) и при туберкулёзном экссудативном плеврите (100%).
Таблица 1
Определение антител к M. tuberculosis в сыворотке крови больных различными клиническими формами туберкулёза Клиническая форма заболевания Объем выборки,
n Доля пациентов с наличием АТ, %
Туберкулёз лёгких (БК+, БК–)
инфильтративный
диссеминированный
фиброзно-кавернозный
90
82
70
68,0
71,0
87,0
Экссудативный плеврит (только БК+) 3 100,0
Казеозная пневмония (только БК+) 14 86,0
Туберкулёз лимфатических узлов (БК+, БК–) 20 61,0
Контрольная группа 500 5,6

(БК+) – больные с бактериовыделением (бациллярная форма туберкулёза)
(БК–) – больные без бактериовыделения (абациллярная форма туберкулёза)

В контрольной группе уровень АТ к M. tuberculosis был повышен только в 5,6% случаев, что достоверно свидетельствует о достаточно высокой специфичности тест-системы (94,4%). С использованием тест-системы “АТ-Туб-Бест” был также проведен анализ образцов сыворотки крови от лиц с неустановленным на момент забора образца крови диагнозом “туберкулёз” из 5 различных групп (табл. 2).
Таблица 2
Определение антител к M. tuberculosis в сыворотках крови лиц с не установленным на момент обследования диагнозом “туберкулёз” Группы обследуемых лиц Доноры,n=80 Контактные лица, n=58 Пациенты наркодиспансера, n=42 Больные гепатитами В или С, n=106 ВИЧ-инфицированные, n=18
Кол-во пациентов с повышенным уровнем АТ, n (%) 4 (5,0) 14 (24,1) 12 (28,6) 17 (16,1) 5 (27,8)
из них впоследствии были выявлены признаки туберкулёза, n (%) 2 (50,0) 3 (21,4) 6 (50,0) 11 (64,7) 3 (60,0)


В результате проведенного исследования АТ к M. tuberculosis были обнаружены только у 5,0% условно здоровых доноров, тогда как процент выявления специфических АТ у контактных лиц – родственников больных туберкулёзом – был выше почти в 5 раз и составил 24,1%. Это, вероятно, может быть связано с “постоянной иммунизацией” последних микобактериями за счет их высокой концентрации во внешней среде.

Сероположительной оказалась также почти треть пациентов наркологического диспансера и ВИЧ-инфицированных лиц, а у больных гепатитами В или С антитела к микобактериям были выявлены в 16% случаев. Большое количество положительных результатов среди обследованных наркоманов, скорее всего, обусловлено соответствующими социальными условиями, а среди пациентов, инфицированных ВИЧ или вирусами гепатитов, тем, что данные хронические заболевания нередко приводят к значительному снижению иммунного статуса.

Все лица с повышенным уровнем АТ к M. tuberculosis были направлены на углубленное клиническое обследование, в результате которого у большинства из них был действительно выявлен активный туберкулёз (табл. 2). Причем признаки туберкулёза были обнаружены и у 50% (2 из 4) условно здоровых доноров с наличием АТ к микобактериям, хотя этот факт мог быть связан с ранее перенесенным заболеванием.

Таким образом, результаты настоящего исследования показали, что чувствительность иммуноферментной тест-системы “АТ-Туб-Бест” в зависимости от формы заболевания составляла от 61% (при туберкулёзе лимфатических узлов) до 87% и выше (при фиброзно-кавернозном туберкулёзе легких, казеозной пневмонии и экссудативном плеврите), а специфичность анализа, определенная при исследовании сыворотки крови здоровых доноров, была равна 95%.

Опубликованные другими авторами и наши собственные данные показывают [1, 6–8, 13], что диагностика туберкулёза, основанная на определении АТ к M.. tuberculosis с помощью ИФА, является вполне эффективной и должна иметь среди других диагностических методов свою четко очерченную нишу. Широкая освоенность ИФА лабораториями, простота его постановки и возможность получения результатов исследования большого количества проб за 2–3 ч позволяют успешно использовать данный метод серодиагностики туберкулёза для скрининга, выявления групп риска и оценки эпидемиологической обстановки. Хотя сам по себе факт превышения порогового уровня специфических АТ у пациента не свидетельствует об активном туберкулёзе, он становится весомым поводом для проведения дальнейшего углубленного обследования с привлечением других методов и данных клиники. Определение АТ к M. tuberculosis у выздоравливающих больных может быть полезно при выборе дальнейшей тактики лечения, а у выздоровевших – для оценки вероятности возникновения рецидива. Наконец, результаты данного исследования могут дать ценную информацию для дифференциальной диагностики туберкулёза в сложных и сомнительных случаях, например при внелегочной локализации процесса или при онкопатологии в области грудной клетки.

Литература
Внелегочный туберкулёз / Под ред. А.В. Васильева. СПб.: ИКФ “Фолиант”, 2000. 568 с.
Туберкулёз: Руководство для врачей / Под ред. А.Г. Хо-менко. М.: Медицина, 1996. 258 с.
Хоменко А.Г. // Русский медицинский журнал. 1995. № 1. С. 5–21.
Васильев А. В., Карпов А.В. // Проблемы туберкулёза. 1996. № 1. С. 13–15.
Галкин В.С., Ягофарова Р.К., Вишневская Е.Б., Карпов А.В. // Тез.. докл. конф. “Соврем. проблемы фтизиатрии и иммунологии в Сибири”. Томск, 1994. С. 5–6.
Карпов А.В. // Вестн. Новгородск. гос. университета. 1998. № 7. С.1–3.
Chan E.D., Reves R., Belisle J.T. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. V. 161. Р. 1713–1719.
Al Zahrani K., AL Jahdali H., Poirier L. et al. // Am. J. Res-pir. Crit. Care Med. 2000. V. 162. Р. 1323–1329.
Баранов И.И., Борисов В.А., Филиппова О.П. и др. // Тез. докл. конф. “Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера”. Новосибирск, 1998. С. 177–178.
Хоменко А.Г. Туберкулёз органов дыхания. М., 1981. 487 с.
Беклемишев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция (при инфекциях, инвазиях и аллергиях). М.: Медицина, 1986. 256 с.
Шендерова Р.И., Якунова О.А., Новикова Н.С. и др. // Иммунология. 1998. № 6. С. 25–28.
Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров В.И. // Новости “Вектор-Бест”. 1998. № 3 (9). С. 3–7.


Применение набора реагентов "АТ-Туб-Бест"
для диагностики туберкулеза (вопросы и ответы)
Иммуноферментные тесты, определяющие антитела к M. tuberculosis, в настоящее время широко применяются в лабораторной диагностике туберкулеза за рубежом. Результаты ряда опубликованных работ [1-4], в том числе наших собственных [5, 6], однозначно свидетельствуют о том, что использование полученных с помощью этих тестов данных в комплексе с результатами других лабораторных методов позволяют осуществлять диагностику различных форм туберкулеза более эффективно. Однако как у практикующих фтизиатров, так и у специалистов лабораторной диагностики нередко все еще возникают вопросы, связанные с особенностями диагностики туберкулеза, опирающейся на определение специфических антител в периферической крови. На некоторые из этих вопросов, касающиеся практического применения набора реагентов "АТ-Туб-Бест", мы попытались ответить в данном сообщении.

- Почему чувствительность набора не достигает 100%?

У людей, инфицированных микобактериям, но не болеющих туберкулезом, в крови могут выявляться специфичные антитела (АТ). Уровни этих антител варьируют и зависят от многих причин. Если занизить пороговый (дискриминационный) уровень анализа, то при использовании набора реагентов "АТ-Туб-Бест" положительные результаты могут быть получены для людей с неактивным процессом. Поэтому уровень специфических АТ рассчитан на выявление при анализе только активной формы туберкулеза.

- Почему специфичность набора менее 100%?

Для определения специфичности анализа использовали группу условно здоровых доноров со станции переливания крови. Нельзя исключить, что некоторые из них когда-то болели или болеют активным туберкулезом. Специфичность анализа, в принципе, можно повысить, увеличив концентрацию специфических АТ в отрицательном контрольном образце, определяющем пороговый или фоновый уровень противотуберкулезных АТ. Однако это приведет к снижению чувствительности анализа, поскольку она имеет обратную связь со специфичностью. Набор в этом случае будет менее эффективно выявлять АТ у больных туберкулезом с гуморальными иммунодефицитами.

- Каков будет результат анализа при обследовании здоровых людей, никогда не болевших туберкулезом, с положительной реакцией Манту или вакцинированных БЦЖ?

Почти всегда отрицательный, поскольку набор настроен на выявление только активного туберкулеза. В то же время при провокации микобактериальным антигеном (туберкулин, БЦЖ) у "иммунодефицитных" больных туберкулезом, с пониженным уровнем специфических АТ, их концентрация в крови может существенно возрасти и превысить диагностический уровень набора. Это в ряде случаев позволяет диагностировать активный туберкулез. Такой подход иногда применяют в неясных и сомнительных случаях. Здоровый человек, как правило, не отвечает на такую провокацию повышением уровня АТ.

- Будет ли результат анализа положительным при обследовании людей, когда-либо болевших туберкулезом?

Да, такая вероятность достаточно велика, поскольку специфические иммуноглобулины класса G (IgG) циркулируют в крови лиц, переболевших туберкулезом длительное время. В этом случае необходимо обязательно анализировать всю информацию о перенесенных заболеваниях в анамнезе.

- Возможен ли положительный результат анализа при нетуберкулезном заболевании, но с симптоматикой, похожей на туберкулез?

Нет, невозможен, такие случаи могут быть обусловлены только ранее перенесенным туберкулезом.

- Влияет ли на результаты анализа ВИЧ-инфекция?

Нет, не влияет, если она еще не переросла в развитый СПИД с глубокими поражениями иммунной системы. Это относится также и к иммунодефицитам другой этиологии.

- Может ли анализ быть положительным при других заболеваниях?

Он может быть положительным при туберкулезе, вызванном не M. tuberculosis, а такими микобактериями, как M. bovis, M. afrikanum, M. avium, M. intracellulare и др., а также БЦЖ. Кроме того, он будет положительным при проказе, вызываемой M. leprae. Однако это заболевание легко отличить от туберкулеза по общей клинической картине.

- Может ли набор использоваться для мониторинга эффективности лечения?

В большинстве случаев не может, так как специфические IgG у некоторых пациентов могут обнаруживаться в крови длительное время и после полного излечения.

- Каким должен быть вывод, если результат анализа положительный, а микобактерии в мазке или мокроте не обнаружены?

При наличии характерной симптоматики больному следует поставить диагноз "активный туберкулез". Известно, что абациллярные формы туберкулеза (БК-) встречаются значительно чаще, чем бациллярные (БК+).

- Каким должен быть вывод, если результат анализа положительный, однако у пациента отсутствуют характерная симптоматика, объективные положительные данные рентгеноскопии, а также микобактерии в мазке или мокроте?

В этом случае оснований ставить диагноз "активный туберкулез" нет. Возможно, пациент болел туберкулезом ранее.

- Каким должен быть вывод, если результат анализа отрицательный, а в мазке или мокроте обнаружены микобактерии?

Имеются полные основания поставить диагноз "активный туберкулез".

- Какими должны быть действия фтизиатра, если при наличии туберкулезоподобной симптоматики результат анализа отрицательный?

Необходимо провести дополнительное углубленное обследование пациента с помощью всей совокупности методов диагностики туберкулеза.

- Зачем определять специфические АТ, если можно воспользоваться пробой Манту?

Проба Манту при высокой чувствительности обладает крайне низкой специфичностью и малоинформативна при постановке диагноза "активный туберкулез".

- Зачем определять специфические АТ, если можно применить такие современные методы, как ПЦР-анализ или анализ индукции цитокинов?

Перечисленные методы, также как и ИФА, являются современными методами диагностики, имеющими свои достоинства и недостатки. Так, например, ПЦР в силу своей высокой чувствительности не всегда может отличить активный туберкулез от туберкулезной инфекции. Анализ индукции цитокинов - высокочувствительный, но пока еще недостаточно специфичный метод. В принципе, все эти тесты могут внести свою лепту в диагностику туберкулеза, ее эффективность может возрасти при их комплексном использовании.

Литература

Карпов А.В. // Вестн. Новгородск. гос. университета. 1998. № 7. С.1-3.
Chan E.D., Reves R., Belisle J.T. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. V. 161. Р. 1713-1719.
Al Zahrani K., AL Jahdali H., Poirier L. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. V. 162. Р. 1323-1329.
Внелегочный туберкулез / Под ред. А.В. Васильева. СПб.: ИКФ "Фолиант", 2000. 568 с.
Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров В.И. // Новости "Вектор-Бест". 1998. № 3 (9). С. 3-7.
Гладкова С.Е., Решетников С.С., Пряхина В.Н. // Новости "Вектор-Бест". 2006. № 4 (42). С. 2-4.


Новая тест-система для серодиагностики туберкулёза

С.С. Решетников, зав. лабораторией иммунохимии

С.Е. Гладкова, н. с. лаборатории иммунохимии

В.И. Офицеров, директор по науке ЗАО “Вектор-Бест

Туберкулёз преследует человечество на протяжении всей его истории. К известным ранее факторам, способствующим возникновению этого заболевания (бедность, скученность, неполноценное питание), сейчас добавились новые: распространение СПИДа, стресс, загрязнение окружающей среды. За последние 5–6 лет заболеваемость туберкулёзом резко возросла не только в странах третьего мира, но и в развитых государствах. По данным ВОЗ, в 1995 году число больных туберкулёзом составило более 20 млн. человек, из которых умерло более 3 млн. (больше, чем от любой другой инфекционной болезни). В 1996 году туберкулёзом на земном шаре заболело около 8 млн. человек, в России в 1997 году — 81100 человек.

Туберкулёз более известен как заболевание легких, хотя он может поражать практически любой орган или систему органов. В последнее время получили распространение ранее довольно редкие формы: мелкоочаговый туберкулёз, туберкулёз периферических лимфатических узлов и туберкулёз половых органов. Все чаще туберкулёз встречается в составе сочетанных инфекций.

Возбудитель туберкулёза Mycobacterium tuberculosis распространяется, в основном, в виде аэрозолей при кашле и чихании, а также при контакте слизистых оболочек. При определенных условиях возбудителями туберкулёза могут быть также Mycobacterium bovis и Mycobacterium africanum. Причем заразными, по некоторым данным, могут быть не только люди, но и больные животные. Несмотря на контагиозность возбудителя (особенно M. tuberculosis) подавляющая часть инфицированных им людей не заболевает, и туберкулёз у них протекает в неактивной форме. Вероятность возникновения активного туберкулёзного процесса у таких людей в течении жизни составляет обычно не более 10%. Однако воздействие факторов риска может привести к разбалансировке защитных механизмов организма и “пробою” иммунитета. В таких случаях вероятность развития активной формы туберкулёза значительно возрастает. Например, среди ВИЧ-положительных пациентов риск заболевания туберкулёзом возрастает на 10% за каждый год сочетанной инфекции.

По данным ВОЗ, для туберкулёза при отсутствии медицинской помощи характерна высокая смертность (55%). Эффективность современной терапии туберкулёза, достаточно высокая на ранних стадиях заболевания, резко снижается на более поздних стадиях. Поэтому смертность даже среди леченных больных в целом достигает 15 %. В этой связи ранняя диагностика туберкулёза может иметь решающее значение, при условии быстрого фармакологического вмешательства она способна существенно сократить заболеваемость и смертность от туберкулёза.

Определяющими требованиями к методам диагностики являются специфичность и чувствительность. Если метод имеет недостаточную специфичность, то при его использовании будет получено большое число ложноположительных результатов среди здоровых людей или среди нетуберкулёзных больных. Недостаточно чувствительный метод будет “пропускать” слишком много действительно больных активным туберкулёзом, а слишком чувствительный — может давать положительный результат при тестировании здоровых людей с неактивной формой туберкулёза или пациентов, относительно недавно вакцинированных БЦЖ. При выборе метода диагностики немаловажную роль также играют: время анализа, его стоимость, воспроизводимость результатов, а также возможность объективного инструментального учета результатов.

Среди классических методов диагностики туберкулёза лёгких, по-видимому, наибольшей специфичностью обладает метод идентификации культуры возбудителя в посеве мокроты пациента. Широко применяется также цитологическое (микроскопическое) определение микобактерий в мазках мокроты и плеврального экссудата больных после окраски прочным синим (АFВ-метод). Однако оба этих метода оказываются непригодными при небациллярных формах туберкулёза, когда микобактерии отсутствуют в биологических жидкостях. Поскольку такие формы туберкулёза встречаются в 2–3 раза чаще бациллярных, общая эффективность выявления больных при использовании данных методов невысока. Кроме того, культивирование микобактерий, из-за их медленного роста, достаточно длительная (около 1 месяца) и дорогая процедура, а цитологическая идентификация не обладает достаточной чувствительностью, чревата ошибками и слишком сильно зависит от квалификации персонала (при использовани и теста в лабораториях развивающихся стран выявляется 20–40% больных туберкулёзом, в развитых странах ~ 40–60%).

При небациллярной форме туберкулёза лёгких и при туберкулёзе других органов определенное значение может иметь обследование вышеописанными методами биоптатов пораженной ткани. Однако на практике это, как правило, проводится лишь на достаточно поздних стадиях заболевания.

Диагностика легочного туберкулёза, основанная на рентгеноскопии грудной клетки, может давать неадекватные результаты из-за возникших под действием самых разнообразных факторов неспецифических изменений в лёгких. Кроме того, при различных сочетанных инфекциях, например, туберкулёз+ВИЧ, картина рентгеноскопии вообще может сильно отличаться от классической (характерной для активного процесса в лёгких).

В целом, три описанных выше метода диагностики туберкулёза (идентификация культуры, АFВ-метод и рентгеноскопия) малопригодны для массового скрининга населения, осуществимы только в специализированных лабораториях и требуют серьёзного финансирования. Практически всегда они используются лишь для подтверждения диагноза “активный туберкулёз”, а не для его обнаружения. В результате, ранняя диагностика туберкулёза зачастую основывается лишь на клинической картине и совокупности косвенных признаков. А принимаемые по этому поводу решения полностью зависят от квалификации и опыта врача.

Говоря о современных методах диагностики туберкулёза, нельзя не упомянуть о методе полимеразной цепной реакции (ПЦР или PCR). Это высокоспецифичный и чрезвычайно чувствительный тест, с помощью которого принципиально возможно идентифицировать в анализируемой пробе наличие даже одной-единственной молекулы ДНК возбудителя. На метод ПЦР возлагали большие надежды, он постоянно совершенствуется и в настоящее время, в принципе, уже нашел свою нишу в диагностике туберкулёза.. Недостатками его являются высокая цена, сложность, дорогое инструментальное и приборное обеспечение. Кроме того, из-за своей сверхвысокой чувствительности этот тест часто определяет неактивную форму туберкулёза и очень зависим от уровня квалификации персонала и соблюдения особых требований к лабораторным помещениям, в которых проводится анализ. Минимальное загрязнение анализируемых образцов, инструментария и воздуха в помещении нуклеиновой кислотой микобактерий может дать ложноположительный результат. Поэтому применение этого метода в практике лабораторной диагностики пока довольно ограничено.

Разнообразие форм туберкулёза, быстрое распространение в последнее время внелёгочных форм со “стертой” картиной процесса заболевания, а также весьма индивидуальная реакция на него организма пациентов, представляют собой серьёзную проблему для диагностики туберкулёза вообще и для ранней его диагностики, в частности.

Относительно широкие возможности для скрининга туберкулёза предоставляют методы серодиагностики, среди которых наиболее распространены тесты, основанные на определении антител к антигенам микобактерий. Результаты серологических тестов в гораздо меньшей степени зависят от того, в какой форме — бациллярной или абациллярной — проявляется туберкулёз. Благодаря своей относительно невысокой стоимости, скорости, достаточно высокой чувствительности и специфичности, они незаменимы при массовых обследованиях. Казалось бы, что с серологическими методами конкурирует недорогой и простой в исполнении кожный туберкулиновый тест (реакция Манту), являющийся показателем напряженности клеточного иммунитета. Однако, из-за низкой специфичности и, по сути, неспособности дифференцировать активные и неактивные формы туберкулёза его применение в большинстве случаев вряд ли оправдано. Напротив, гуморальный иммунный ответ весьма характерен именно для активного процесса, поэтому серологические тесты, в которых провод ится определение специфичных к M. tuberculosis антител, намного достовернее кожных тестов.

Серологические методы отличаются большим разнообразием. Традиционные тесты, основанные на реакциях гемагглютинации, торможении гемагглютинации, фиксации комплемента и некоторые другие, относительно просты в постановке, недороги, имеют небольшое время проведения анализа (от 1 часа до суток), нуждаются в минимуме оборудования. Однако они в настоящее время морально устарели и, кроме того, эффективная диагностика туберкулёза с их помощью возможна только при комбинированном совместном использовании сразу нескольких тестов, например, РНГА+РПК+РПГ.

Результаты анализа при постановке традиционных серологических методов довольно плохо поддаются инструментальному учету. Поэтому к их недостаткам можно добавить известный субъективизм визуальной оценки и, следовательно, не слишком хорошую воспроизводимость результатов теста в “серой зоне” при невысоких титрах антител к антигенам микобактерий.

К современным методам серодиагостики туберкулёза, получившим в последнее время достаточно широкое применение, относятся иммунохроматография и дот-блоттинг. Тест-системы, в которых используются эти принципы, приспособлены для простого в исполнении экспресс-анализа с визуальной оценкой результата.

К иммунохроматографическим диагностикумам относится выпускаемый в Австрии набор “ТВ-Check-1”. Постановка анализа в данной тест-системе не вызывает особых затруднений у лаборанта и позволяет получить результат тестирования за 25–35 минут. К недостаткам теста можно отнести высокую стоимость анализа и серьёзную зависимость оценки результата от оператора при невысоком титре специфичных антител (т.е. в “серой зоне”).

Примером тест-системы, в которой используется дот-блоттинг, может служить набор “МycoDot”, выпускаемый фирмой “DynaGene”. Постановка анализа с применением данного набора сложнее, чем тестирование образцов в тест-системе “ТВ-Check-1”. Однако при его использовании за счет положительных и отрицательных контролей достигается большая точность визуальной оценки результата, а стоимость анализа несколько меньше, чем в тест-системе “ТВ-Check-1”.

Среди современных методов серодиагностики туберкулёза наибольшее распространение в России получили иммуноферментный и радиоиммуный анализы (ИФА и РИА). При их использовании, как правило, применяется инструментальный учёт и автоматическая (компьютерная) обработка результатов анализа, что позволяет исключить субъективную оценку. Для тест-систем, в которых используются принципы ИФА и РИА, характерны высокие технический уровень, степень стандартизации и воспроизводимость результатов анализа. Они удобны в работе и позволяют проводить одновременное тестирование большого количества проб, т.е. проводить скрининг. Сравнительные характеристики современных тест-систем приведены в таблице 1.

Таблица 1

Достоинства и недостатки современных тест-систем для серодиагностики туберкулеза

№
Метод
Достоинства
Недостатки

1.
Иммунохрома-тография

(ТВ-Check-1), одностадийный метод
Время анализа 25ѕ 35 мин;

Простота исполнения;

Одностадийный анализ;

Не требует приборного обеспечения.
Высокая цена анализа (8ѕ 12$);

Невозможность инструментального учета и субъективизм оценки результатов;

Отсутствие положительного контроля.

2.
Дот-блотинг (MycoDot), двухстадийный метод
Время анализа 35–45 мин

Относительная простота исполнения;

Наличие отрицательного и положительного контроля и сравнительной цветовой шкалы;

Минимальное приборное обеспечение (флаконы, пипетки).
Относительно высокая цена анализа (4–8 $);

Невозможность инструментального учета;

Трудности с оценкой результата в “серой зоне”

3.
Твердофазный ИФА на стрипах, двухстадийный метод
Время анализа 1,5–2 ч;

Наличие положительного и отрицательного контролей;

Возможность использования инструментального и визуального учета результатов анализа.

Объективная и точная оценка результатов при инструментальном учёте.

При визуальном учете - минимальное приборное обеспечение (флаконы, пипетки).

Низкая стоимость анализа (1–1,5 $);

Удобен и выгоден для проведения массовых анализов.
Относительная трудоёмкость анализа (2 стадии + промывка + ферментативная окраска);

Необходимость фотометра при использовании
инструментального учета результатов.




Интенсивное развитие метода ИФА в последние 10–15 лет привело к тому, что иммуноферментные тест-системы по своим характеристикам, и в первую очередь по чувствительности, стали сравнимыми с радиоиммунными тестами. Проведение ИФА, в отличие от РИА, не требует оборудованных для работы с радиоактивностью помещений, высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, кроме того, стоимость анализа значительно ниже. Поэтому в большинстве лабораторий иммуноферментные тест-системы вытеснили радиоиммунные.

При использовании современных иммуноферментных диагностикумов на туберкулёз проблемы, связанные с недостаточной специфичностью, возникают достаточно редко. Однако их чувствительность, как правило, не удовлетворяет практических врачей. Дело в том, что антитела к микобактериям в том или ином количестве присутствуют в крови не только больных, но и здоровых инфицированных людей. В сыворотке крови больных титры антител могут иногда достигать очень больших величин, однако этот показатель слишком неявно (неопределенно) связан с давностью инфицирования или тяжестью заболевания. В большей степени он опосредуется особенностями течения болезни и состоянием иммунной системы пациента. Титры антител у людей с неактивным туберкулёзом обычно всё-таки существенно ниже, чем у больных, и это дает возможность при соблюдении определенных правил вывести некий дискриминационный уровень, при преодолении которого можно говорить о высокой вероятности активного туберкулеза.

Методы серодиагностики туберкулёза постоянно совершенствуются и развиваются, вместе с тем, ряд проблем не получил полного разрешения. Учитывая специфику заболевания (наличие неактивного и активного вариантов туберкулёза, многообразную локализацию процесса, индивидуальность реакций иммунной системы), достичь 100% чувствительности, вероятно, невозможно. Однако к этой отметке можно попытаться максимально приблизиться.

При разработке новой тест-системы для иммуноферментной серодиагностики туберкулёза сотрудники фирмы “Вектор-Бест” выделили два ключевых момента:

Во-первых, поскольку у каждого больного при возникновении активной формы туберкулёза вырабатывается свой собственный, индивидуальный спектр антител, при конструировании тест-системы было решено использовать не один-два, а комплекс наиболее иммуногенных антигенов в расчете на более универсальную чувствительность по отношению к различным формам туберкулёза.

Во-вторых, тест-система должна выявлять специфичные антитела, принадлежащие ко всем классам иммуноглобулинов. Большинство тест-систем рассчитано на определение только иммуноглобулинов класса G, поскольку считается, что IgM-антитела присутствуют в крови только в начале заболевания и, в основном, при неактивном туберкулёзе, а при развитии активного процесса уже исчезают. Однако это касается главным образом взрослых. У детей же IgM к возбудителю туберкулёза нередко присутствуют в крови в течение 2-х лет после начала заболевания, причем их уровень значителен даже при относительно низких титрах IgG.

Антитела класса IgA могут определяться при туберкулёзе как в крови (сывороточный IgA), так и в секретах, моче, мокроте (секреторный IgA). Часто в диагностической практике происходит недооценка этого факта. Установлено, что уровень специфических IgA при туберкулёзе подвержен значительным колебаниям, однако это относится в основном к секреторному IgA. В ряде опубликованных в последнее время работ сообщалось о увеличении чувствительности серологического анализа на туберкулёз (на 10–20%) при одновременном определении IgG и сывороточных IgA. По предварительным данным, полученным сотрудниками фирмы “Вектор-Бест”, дополнительное к IgG определение специфичных антител IgA и IgM у детей 7–13 лет увеличивает чувствительность ИФА-теста в среднем на 40 % без снижения специфичности.

При проведении исследований по разработке новой иммуноферментной тест-системы, названной “АТ-ТУБ-Бест”, полученные результаты сравнивали с данными анализа в тест-системах “Акватуб-АТ-1” (производства фирмы “Аквапаст”, Санкт-Петербург) и “МycoDot” (“DynaGen”, США). В табл. 2 приведены сравнительные характеристики чувствительности указанных тест-систем на двух выборках сывороток крови больных из Казахстана и г. Новосибирска и на здоровых донорах (СПК г. Новосибирска).

Таблица 2

Данные сравнения тест-систем на микропанелях сывороток трех групп

Исследуемые группы пациентов

Тест- системы
Взрослые больные
(n = 110*)
Больные дети,
находящиеся
на излечении (n = 15)
Доноры со станции
переливания крови
(n = 18)


(+)
(± )
(- )
(+)
(± )
(- )
(+)
(± )
(- )

АкваТуб-АТ-1
40 (36,4%)
22
48
4 (26,7%)
0
11
0
1
17

АТ-ТУБ-Бест
93 (84,5%)
7
10
10 (66,7%)
0
5
1 (5,5%)
0
17

MycoDot
12
(66,7%)
2
4
5 (33,3%)
1
9
-
-
-




В результате проведенных предварительных исследований найден оптимальный вариант конструкции тест-системы, обеспечивающий ей более высокую чувствительность (при сохранении специфичности) по сравнению с тест системой “Акватуб-АТ-1” Это достигается за счет использования для иммобилизации на подложку очищенного комплекса антигенов микобактерий, а также применения сбалансированного пероксидазного конъюгата антивидовых антител к иммуноглобулинам трёх основных классов — G, M, и A.

Комплектация тест-системы готовыми к работе планшетами с сорбированным и стабилизированным в лунках антигеном позволяет упростить анализ и сократить его время. В набор тест-системы “АТ-ТУБ-Бест” входят все необходимые для проведения анализа реактивы и материалы. Дополнительное оборудование при визуальном учёте результата: флаконы, автоматические пипетки; при инструментальном — флаконы, автоматические пипетки, фотометр (с детекцией при 492 нм).

Идеальных тест-систем не существует. Диагностика туберкулёза очень сложна, и ни один тест не может быть самодостаточен. Только учтя все клинические симптомы и результаты анализов, можно сделать более-менее правильные выводы. Скрининговые обследования — это только начальный этап в диагностике туберкулёза. Обнаружение специфических антител в крови ещё не может служить достаточным основанием для постановки диагноза. Иногда высокие уровни антител могут быть и у здоровых людей, когда-то болевших туберкулёзом. Положительный результат может служить основанием лишь для немедленного углубленного обследования пациента, которое должно включать контроль характерных для активного туберкулёза симптомов (персистирующий кашель и субфебрильная температура, ночное потоотделение, боли в грудной клетке, общее недомогание, изменение в суставах и т.д.), анализ крови (лейкоцитоз), рентгеноскопию грудной клетки и обследование других органов, со стороны которых есть определенная симптоматика.
Скрыть